閾值，我們在操作軟件時上下拉動的橫線，是決定Ct值的因素之一。

閾值是熒光信號相對于基線有顯著增強的點，大多數儀器會根據基線平均信號，自動計算熒光信號的閾值水平，并設置一個比平均值高10倍的閾值。

也就是說，當基線被正確的設置了，閾值也能手動調整成正確值。

需要注意的是：

1、讀取閾值相關的分析數據時，不能隨意改變閾值的設置。只有分析不同樣本，或相同樣本不同靶基因時，才能調整閾值。

2、設置閾值線時，要在擴增曲線的指數擴增區域內設置，不能在起始階段，也不能在熒光背景（基線）區域。

3、每次改變閾值時，要查看標準曲線的斜率和R的平方有沒有改善。沒有使用標準曲線時，也可以計算3個復孔（相同條件擴增的樣本）的標準偏差。好的閾值應該要改善Ct值的表現。