簡介

在動物細胞培養(yǎng)過程中，必須有可以貼附的支持物表面，其依靠自身分泌或培養(yǎng)基中的貼附因子才能在該表面生長增殖的離體動物的培養(yǎng)細胞。

由于血清具有終止胰蛋白酶消化，提供細胞生長所需的貼壁因子、免疫球蛋白、胰島素等其它營養(yǎng)成分及細胞因子，因此成為體外細胞培養(yǎng)液中的常用添加成分，其對細胞的培養(yǎng)意義重大。

原理

細胞在人工基質上單層生長（貼壁培養(yǎng)）
貼壁細胞分類：皮細胞型，成纖維細胞型，游走細胞型和多型細胞型。

在顯微鏡下觀察時，貼壁細胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不規(guī)則的三角形或扇形或其它形態(tài)，而且晃動培養(yǎng)液時，細胞不動。

培養(yǎng)細胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣；當與底物貼附后，細胞將逐漸伸展而形成一定的形態(tài)，呈成纖維細胞樣或上皮細胞樣等。

材料與儀器

【材料與試劑】細胞、PBS 或 DPBS、0.25% (w/v) Trypsin-EDTA、75% 乙醇、培養(yǎng)基（以DMEM為例）、100X 雙抗（鏈霉素-青霉素）、胎牛血清、細胞凍存液。

【實驗儀器與耗材】培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶、移液槍、離心管、記號筆、封口膜、凍存管、程序降溫凍存盒、液氮罐、離心機、37℃ 恒溫培養(yǎng)箱（5% 二氧化碳濃度）、倒置相差顯微鏡、冰箱、無菌細胞操作臺。

步驟

一、試劑準備
DMEM*培養(yǎng)基（10% 胎牛血清）：44.5 mL DMEM +5 mL 胎牛血清+500 μL 100X 雙抗，搖勻，4 ℃ 冷藏保存，使用前于 37 ℃ 恒溫水浴鍋中預熱 15 分鐘。

PBS、*培養(yǎng)基、根據(jù)細胞特性選擇合適的解離液（例如Gibco? TrypLE? Express、胰蛋白酶）或機械吹打消化細胞、胰蛋白酶解離劑 0.25%  (w/v) Trypsin-EDTA 4℃ 冷藏保存，使用前于37 ℃ 恒溫水浴中鍋預熱 15 分鐘。

二、 細胞復蘇
1. 超凈工作臺使用前紫外線照射 30 分鐘。使用前，后用 75% 酒精擦拭臺面。保持臺面干凈整潔。使用時一定打開通風。

2. 將凍存細胞從-80 度冰箱或液氮罐中取出，立即放入（2分鐘內）37 ℃ 恒溫水浴中預熱水浴鍋中（或在手心中反復摩擦），不停晃動以化凍。

3. 立刻將化凍的細胞液轉移進裝有 3 mL DMEM*培養(yǎng)基的 5 mL離心管中并吸打均勻。注意液體不要留在瓶口或瓶蓋上，避免增加污染的可能。

4. 復蘇細胞時，離心機提前降溫至4℃，以 1000 rpm 的轉速將細胞懸液離心 5 分鐘并棄上清（離心的速度和時間根據(jù)細胞系的不同有所差異）。

5. 用 3 mL DMEM*培養(yǎng)基重懸細胞，并轉移進 6 cm細胞培養(yǎng)皿中，放入細胞培養(yǎng)箱中。

6. 在顯微鏡下觀察復蘇細胞的狀態(tài)（是否為單個細胞懸液，有無成團，活細胞的比例），并及時（每48小時）更換DMEM*培養(yǎng)基。

7. 當細胞密度占顯微鏡視野 80%-90% 時，應進行細胞傳代。

三、貼壁細胞傳代（以 6 cm細胞培養(yǎng)皿為例）
1. 棄置原培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，從培養(yǎng)皿邊緣加入 2 mL 預熱的PBS平衡鹽溶液潤洗細胞（注意不要直接沖到細胞表面），并棄置。

2. 沿培養(yǎng)基側壁加入1 mL預熱的 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA，使胰蛋白酶*覆蓋細胞表面。于細胞培養(yǎng)箱中孵育 2 min（孵育時間根據(jù)細胞系不同有所差異，如不確定細胞消化時間，每隔 1min 取出在顯微鏡下觀察，約有 50-70% 細胞飄起，即可繼續(xù)操作）。

3. 向培養(yǎng)皿中加入1 mL *培養(yǎng)基中和Trypsin的作用，并輕輕吸打細胞表層數(shù)次。將細胞懸液轉移到 5 mL 離心管中，在室溫下以 1000 rpm 的轉速將細胞懸液離心 3 分鐘。

4. 小心棄去離心管中的上清液，使用 1mL *培養(yǎng)基輕輕重懸細胞沉淀，使其*被吹打為單個細胞狀態(tài)，盡量減少泡沫的產生。

5. 進行細胞計數(shù)后以 1:3（1:3～1:6均可）的比例進行細胞傳代。

6. 取三只新 6 cm 細胞培養(yǎng)皿，每只培養(yǎng)皿中加入 3 mL *培養(yǎng)基，將細胞懸液平均分配至三只培養(yǎng)皿中，蓋上蓋子后，按照畫“十字"的操作，將細胞搖勻。

7. 細胞培養(yǎng)皿放入細胞培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細胞狀態(tài)并及時更換培養(yǎng)液。

四、貼壁細胞凍存：
1、細胞處于生長對數(shù)期且狀態(tài)良好時，收集細胞以便凍存；

2、制備冷凍培養(yǎng)液（含DMSO），在 4°C 下保存。注：合適的冷凍培養(yǎng)基取決于細胞系種類。

3、按照貼壁細胞傳代培養(yǎng)過程中用的操作，將細胞解離下來；

4、600 g, 4℃ 離心 5 min 收集細胞，然后棄掉上清，從冰箱取出細胞凍存液重懸細胞，分裝至凍存管中；

5、將凍存管移入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入 -80℃ 冰箱，過夜，第二天移至液氮罐中。

注意事項

1、嚴格進行無菌操作，每次拿取東西時應使用75%乙醇噴灑表面進行充分消毒；

2、細胞培養(yǎng)皿上應清楚標記：操作人、時間、細胞系；

3、化凍細胞速度應快，盡量在 5 min 內完成操作；

4、離心管放入離心機前應用封口膜纏繞；

5、超凈臺使用前應用紫外照射 30 min 以上；

6、所有與細胞直接接觸的材料和儀器均應處于無菌狀態(tài)

7、如果使用培養(yǎng)瓶，在將其放回培養(yǎng)箱之前，若使用的培養(yǎng)瓶的瓶蓋不帶透氣孔，則需旋松瓶蓋，以便進行適當?shù)臍怏w交換；

8、如果細胞培養(yǎng)基已冷藏（2-8°C），使用前在 37℃ 水浴鍋預熱；

9、細胞培養(yǎng)基保持避光儲存；

10、細胞培養(yǎng)基添加 FBS 后，將*培養(yǎng)基放入冰箱（2-8°C）以保持性能。并在 2-4 周內使用含添加劑的培養(yǎng)基，以減少污染機率和 pH 值變化的影響；

常見問題

1. 所有與細胞直接接觸的材料和儀器均應處于無菌狀態(tài)。

2. 如遇Trypsin 消化不佳的細胞（如RAW264.7細胞），可以采取使用無菌的細胞刮刀輕柔的將細胞刮下再處理。

3. DMSO 具有細胞毒性，復蘇細胞的過程操作要迅速，并用 3 倍體積以上的*培養(yǎng)基進行稀釋。

4. 細胞復蘇后應在 12～24 h 后觀察細胞狀態(tài)。如遇到細胞污染，應立即丟棄細胞，并對環(huán)境進行消毒。

5. 凍存細胞應選擇傳代次數(shù)較少的細胞，當細胞傳代高于15 代后，細胞應丟棄，復蘇新的細胞再進行試驗。

6. 復蘇后的細胞不能立即進行試驗，需傳代 2-3 代，待細胞生長狀態(tài)穩(wěn)定后，才可進行相關試驗。復蘇后細胞狀態(tài)不佳，可考慮重新復蘇；

若重新復蘇后細胞狀態(tài)仍舊不佳，可考慮適當提高胎牛血清的比例（從10%提升至15%，最大提升至20%），待細胞狀態(tài)恢復后再使用平時使用的培養(yǎng)基。

7. 如想收獲到更多數(shù)量的細胞，可以將 6 cm皿細胞懸液接種于10 cm皿中，并增大*培養(yǎng)基的使用量。

8、復蘇細胞后細胞狀態(tài)差：1）首先，凍存細胞時選擇處于對數(shù)生長期狀態(tài)良好的細胞；2）復蘇時，水浴鍋提前預熱至37℃，離心機提前降溫至 4℃；

9、細胞交叉污染：1）培養(yǎng)細胞系時盡量不要多種細胞系同時培養(yǎng)；2）不同細胞系培養(yǎng)基單獨配置，盡量不要交叉使用；3）注意操作規(guī)范；