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    miRNA實驗解決方案(操作手冊)---第三章:miRNA 逆轉錄及實時熒光定量 PCR

    發布時間: 2025-01-08  點擊次數: 48次

    一、miRNA 逆轉錄及實時熒光定量 PCR的概念
    miRNA逆轉錄的概念

    成熟miRNA的長度只有21~23nt,對miRNA進行qPCR定量時,無法直接對其進行正、反向引物的設計(通常正向引物就足以覆蓋miRNA全長),但是可以通過增加逆轉錄產物長度來解決這一問題,miRNA的逆轉錄方法有兩種,分別是莖環法和加尾法。

    實時熒光定量PCR的概念
    實時熒光定量PCR即Real-time PCR,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,最后通過Cr值和標準曲線對未知模版進行定量分析的方法。


    二、miRNA逆轉錄及實時熒光定量PCR的原理

    莖環法原理

    莖環法miRNA逆轉錄最關鍵的一步就是設計莖環逆轉錄引物(由莖環結構和miRNA3'末端六個反向互補的堿基組成),莖環逆轉錄引物首先與miRNA3'末端結合,在逆轉錄酶的作用下進行反應,獲得人為加長的miRNA第一鏈cDNA。針對不同的miRNA,需要設計不同的莖環逆轉錄引物、配制不同的逆轉錄體系,因此莖環法miRNA逆轉錄具有特別高的特異性。

    注:莖環逆轉錄引物中的莖環結構為固定已知序列,只需按照不同的miRNA序列3'末端的六個堿基,將其反向互補添加至莖環結構序列的3'端即可設計出特異性的莖環逆轉錄引物。

    加尾法原理

    增加miRNA逆轉錄產物長度最直接的方法就是增加miRNA的長度,加尾法首先通過PolyA)聚合酶(PAP)向miRNA3'末端添加PolyA)尾,然后在逆轉錄酶的作用下,結合逆轉錄引物(由3'端帶有錨定堿基的Oligo dT序列和一段通用序列組成),即可獲得加長版的cDNA。加尾法逆轉錄可以對提取純化的所有miRNA進行無差別加尾,能夠同時逆轉樣本中多個miRNA,一次逆轉錄即可完成對所有qPCR模板的制備。

    注:錨定堿基NVV代表AGCN代表ATGC中的任意一種)能夠特異性的結合到PolyA)的5'端,以免逆轉出更多的T堿基,保證同一miRNA的逆轉錄產物大小相同;在Oligo dT序列的5'端存在一段可用于qPCR檢測的反向通用引物與cDNA的結合。


    2、熒光定量PCR的化學原理

    變產物DNA分子為熒光信號,通過測定熒光值即可反映產物DNA分子量,實時熒光定量PCR的化學方法有兩種,分別是SYBR®Green染料法和 TaqMan®Probe探針法。

    SYBR®Green 染料法原理

    一種DNA小溝非飽和性結合染料,與DNA結合時發光,不結合(游離)時不發光,每形成一條DNA雙鏈,就會有一定數量的染料結合上去,染料一結合,就會產生熒光信號,信號強度與DNA分子總數目成正比。

    TaqMan®Probe探針法原理

    一種水解探針(5'Reporter3'Quencher),完整時不發光,水解后發光,每形成一條DNA鏈,就會水解一條探針,每水解一條探針,就會產生一個單位信號,信號強度與結合過探針的DNA分子總數目成正比。

    注:探針要先于引物結合在模板上,因此Tm(探針)要比Tm(引物)大810℃

    SYBR®Green 染料法 VS TaqMan®Probe探針法原理

    SYBR®Green 染料法:表達量比較高時推薦使用;

    TaqMan®Probe 探針法原理:表達量比較低時推薦使用;


    三、miRNA逆轉錄及實時熒光定量PCR的操作流程
    1.莖環法miRNA逆轉錄反應
    Vazyme 莖環法 miRNA cDNA 一鏈合成的專用試劑盒 ----------miRNA 1st Stand cDNA Synthesis kit(by stem-loop)(Vazyme #MR101)

    Vazyme #MR101 產品優勢

    1.優秀的線性關系:在寬廣的模版區間內具有良好的線性關系,可檢出低至pg級RNA模版。

    2.優秀的反應體系:最適的Buffer組分及濃度,更適用于miRNA的逆轉錄。

    3.簡便的引物設計:提供配套的引物設計軟件,使得引物設計更加簡便。

    Vazyme #MR101實驗案例-----優秀的線性關系

    以小鼠肝臟組織Total RNA10倍稀釋梯度(10pg1μg)為模板,使用miRNA 1st StrandcDNA Synthesis Kit by stem-loop) (Vazyme MR101)進行逆轉錄,得到的cDNA使用miRNA Universal SYBR qPCR Master MixVazyme MQ101)擴增mmu-miR-16基因。結果顯示, 在寬廣的模板區間內,該配套產品具有優異的線性關系。

    ·注意事項

    1.防止RNase污染:保持實驗區域潔凈;操作時需穿戴干凈的手套、口罩;實驗所用的離心管、槍頭等耗材均需保證RNase-free

    2.5xgDNA Wiper Mix的使用:5xgDNA Wiper Mix含有高濃度的甘油,使用前請短暫離心收集到反應管底部,并用移液器輕輕吹打混勻。不應使槍頭插入液面過深,否則會因槍頭壁的粘附造成酶量的損失。

    3.反應液的配制請在冰上操作完成。

    ·實驗流程

    1.基因組DNA去除

    a.RNase-free 離心管中配制如下混合液:

    用移液器輕輕吹打混勻。

    b.按下列條件進行基因組DNA去除反應:42°C 2min。

    2.第一鏈cDNA合成

    a.在RNase-free離心管中配制如下混合液:

    莖環引物推薦使用本公司miRNA Design軟件進行設計,此時,cDNA產物后續定量產品--miRNAUniversal SYBR qPCR Master MixVazyme MQ101)中配套的逆向qPCR引物可直接使用,無需另外設計合成。
    用移液器輕輕吹打混勻。

    b.按下列條件進行第一鏈cDNA合成反應:

    如果模版具有復雜二級結構或高GC區域,可將反應溫度提高至55°C,有助于提高產量。
    產物可立即用于qPCR反應,短期保存建議存放-20°C;長期保存建議存放-70°C;cDNA應避免反復凍融。

    2、加尾法miRNA逆轉錄反應

    Vazyme 加尾法 miRNA逆轉錄是無法使用普通的逆轉錄試劑盒進行逆轉錄的,因為其缺少PolyA)聚合酶,無法添加PolyA)尾。Vazyme為您提供加尾法miRNA合成cDNA的專用試劑盒-miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kitby tailing A)(Vazyme MR201)。

    ·Vazyme MR201 產品優勢

    1特別優秀的逆轉錄性能:逆轉錄效率高且熔解曲線單峰。

    2.超高的逆轉錄特異性:專為miRNA逆轉錄定向改造的逆轉錄酶,搭配優化的緩沖體系,在保證高靈敏度的同時,最大限度降低 miRNA前體的逆轉錄。

    3.簡便快捷的操作:加尾反應與逆轉錄反應一管進行,使得操作更加方便。

    ·Vazyme MR201 實驗案例一一超高的逆轉錄特異性

    HeLa miRNA為模板(100ngμl),分別使用專為miRNA逆轉錄定向改造的逆轉錄酶(VazymeMR201)和未定向改造的逆轉錄酶(其余組分與Vazyme MR201一致)進行逆轉錄反應,在相同條件下對逆轉錄反應得到的cDNA進行qPCR檢測2個體系。可以看到,使用Vazyme MR201逆轉錄 miRNAqPCR檢測得到的熔解曲線單峰且峰形優異,特異性更高。


    注意事項
    1.防止RNase污染:保持實驗區域潔凈;操作時需穿戴干凈的手套、口罩;實驗所用的離心管、槍頭等耗材均需保證RNase-free。

    2.反應液的配制請在冰上操作完成。

    實驗流程

    1.在RNase-free離心管中配制如下混合液:

    反應中使用的Total RNA必須含有miRNA。
    用移液器輕輕吹打混勻。

    2.按下列條件進行第一鏈cDNA合成反應:

    反應得到的cDNA可立即或稀釋后用于熒光定量,對于高豐度表達的miRNA,可根據具體的Cr值,稀釋10~1000倍。
    cDNA應避免反復凍融,短期保存建議存放-20°C;長期保存建議存放-70°C。

    3、莖環法/加尾法miRNA實時熒光定量PCR

    Vazyme 提供 SYBR Green I嵌合熒光法進行miRNA定量反應的專用預混液-miRNA Unimodal SYBR qPCR Master MixVazyme MQ102),可同時兼容莖環和加尾逆轉產物。

    Vazyme MQ102 產品優勢

    1.高效實驗:附贈U6內參上下游引物,配備莖環通用下游引物及相關設計軟件。

    2.高靈敏度:可在pg級的總RNA中檢測目的miRNA

    3.強特異性:區分單堿基的差異,非特異識別率低于5%。

    Vazyme #MQ102 實驗案例--高效實驗

    Vazyme #MQ102配備了miRNA 莖環引物設計軟件和配套下游通用莖環引物,同時附贈人、大鼠、小鼠通用的U6內參上下游引物,可在寬廣的定量范圍內得到良好的標準曲線。


    Vazyme #MQ102 實驗案例--高靈敏度:

    以293T細胞RNA為模版稀釋6個梯度(1pg-100ng),用miRNA 1st Stand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop)(Vazyme #MR101)進行反轉錄,獲得的cDNA用Vazyme

    MQ102 檢測hsa-miR-21-5p基因表達情況。結果顯示,Vazyme MQ102可在pg級的總RNA中檢測目的miRNA,且能在寬廣的定量范圍內得到良好的標準曲線。




    Vazyme #MQ102 實驗案例--強特異性:

    miRNA序列短,同一家族不同成員序列非常相似,有些僅有單個堿基差別,因此特異性對miRNA定量至關重要。Vazyme MQ102核心酶以雙抗封閉,配以優化的Buffer,能夠區分單堿基的差異,非特異識別率低于5%,實現高特異性定量。

    莖環定量引物設計

    1、正向引物:建議根據完整miRNA序列除去3'末端6個堿基的剩余部分作為miRNA正向特異性引物,并將其中的U替換為T。也可使用本司提供的miRNA Design軟件設計,軟件和說明書請在【諾唯贊-資源支持-實驗工具】處下載。

    2、反向引物::莖環法的qPCR反向通用引物為莖環逆轉錄引物中莖環結構序列的一部分,所用莖環序列為GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC;本產品提供用于qPCR檢測的反向通用引物mQ Primer R,與本公司miRNA Design 軟件設計的逆轉錄引物配套,無需另外合成;當使用不同的莖環序列時,需自行設計合成qPCR下游引物。

    加尾定量引物設計

    1.正向引物:

    建議根據完整miRNA序列設計miRNA正向特異性引物,并將其中的U替換為T

    若根據miRNA序列設計的正向特異性引物退火溫度過低,建議在引物5'端增加幾個堿基(以GC為主),增加堿基后需驗證引物特異性,以免造成非特異性擴增;若引物退火溫度過高,建議刪去5'端幾個堿基。

    ③對于miRNA前體等長片段非特異性擴增,建議在正向特異性引物3'端增加1-3個A堿基。

    對于序列相似的miRNA,建議正向特異性引物3'端終止于差異堿基,若由于引物長度過短而導致退火溫度過低,可在引物5'端增加幾個堿基,使上下游引物Tm值匹配。反向

    2.2、反向引物:本公司Vazyme MR102中提供用于qPCR檢測的反向通用引物 Universalreverse Q primer,退火溫度約為66℃,無需另外合成;當使用不同的逆轉錄試劑時,需自行設計合成qPCR逆向引物。

    ·注意事項

    1.本品盡量避免反復凍融,以免造成酶活下降。如每次使用量較少,推薦小份分裝使用。

    2.使用前請上下顛倒以混勻Master Mix,請勿vortex避免產生氣泡,影響定量結果。MasterMix經混勻短暫離心后即可使用。

    3.由于本品中含有熒光染料SYBR Green1,因此需避光保存,配制反應體系時應盡量避免強光照射。

    4.由于本品檢測靈敏度特高,易被空氣中氣溶膠污染。因此反應體系配制時請于超凈工作臺內進行,配制過程中請使用滅菌槍頭、反應管,條件容許的實驗室推薦使用專用的移液槍和帶濾芯的槍頭。

    5.本品中的藍色染料經測試不影響SYBR GreenI熒光的信號采集。

    ·實驗流程

    1.在qPCR管中配制如下混合液

    莖環法(相對定量內參體系配制參考右表)

    加尾法(相對定量內參體系配制參考右表)


    2.按下列條件進行qPCR反應:


    miRNA逆轉錄及實時熒光定量PCR的常見FAQ
    1.miRNA逆轉錄的常見FAQ

    莖環法VazymeMR101能否用于加PolyA)尾法逆轉錄?

    不能。MR101是通過莖環法逆轉miRNA,利用莖環引物在逆轉錄酶的作用下獲得cDNA。而加PolyA)尾法體系中含有兩個酶的作用,首先是PolyA)聚合酶在單鏈RNA3'端加上一串PolyA)尾,然后利用體系中的Oligo dT通用型引物在逆轉錄酶的作用下進行逆轉錄反應。MR101中沒有PolyA)聚合酶,故不能用于Poly(A)尾法逆轉錄。

    為什么莖環法Vazyme #MR101帶基因組清除組分,而加尾法Vazyme #MR201不帶基因組清除組分?
    因為MR201中的Poly(A)聚合酶(PAP)不能對基因組DNA進行加尾,逆轉錄引物無法識別基因組DNA,所以MR201中不帶專門基因組清除的組分。


    2、實時熒光定量PCR的常見FAQ

    ·miRNA推薦使用的內參:

    small nucleolar RNAsnoRNA)長度約為60300nt左右,在多種組織細胞中高表達,不涉及miRNA的調節途徑,所以snoRNA是很好的內參選擇。研究證實常用的snoRNAassays 包括:

    Human:U6RNU48RNU44U47;

    Mouse:U6snoRNA-202snoRNA-234snoRNA-420;

    還有一類是在不同實驗條件下變化差異很小的miRNA

    Human/mouse tissues: miR-152-186-25-92-26b-16;

    Human/mouse cell lines: miR-374-16-93-186-26b;

    還有一類是傳統沿用的18S rRNA or U6


    莖環法miRNA做逆轉、定量時,內參的逆轉錄引物和qPCR引物如何設計?以常用的U6內參為例,U6的序列足夠長,因此不需要設計莖環引物(當內參產物長度在80bp以上時就不需要設計莖環引物),U6在逆轉錄的時候投入qPCR下游引物即可,可以看作投入逆轉錄的特異性引物逆轉,后續qPCR定量的時候正常投入上下游引物即可。


    加尾法miRNA做逆轉、定量時,內參的逆轉錄引物和qPCR引物如何設計?加尾法逆轉錄可以對提取純化的所有mRNAmiRNA進行無差別加尾,因此不需要對內參做單獨處理。


    擴增曲線形狀異常?

    1.擴增曲線不光滑:信號太弱,經系統矯正后產生,提高模板濃度重復實驗。

    2.擴增曲線斷裂或下滑:模板濃度較高,基線的終點值大于C4值。減小基線終點(C1-4),重新分析數據。

    3.個別擴增曲線突然驟降:反應管內留有氣泡,處理樣本時要注意離心,進行擴增反應之前要仔細檢查反應管內是否有氣泡殘留。

    反應結束無擴增曲線出現?

    1.反應循環數不夠:一般設置循環數為40,但需要注意的是過多的循環會增加過多的背景信號,降低數據可信度。

    2.確認程序中是否設置了信號采集步驟:兩步法擴增程序一般將信號采集設置在退火延伸階段;三步法擴增程序應當將信號采集設置在72℃延伸階段。

    3.確認引物是否降解:長時間未用的引物應先通過PAGE電泳檢測完整性,以排除其降解的可能。

    4.模板濃度太低:減少稀釋度重復實驗,一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

    5.模板降解:重新制備模板,重復實驗。


    Cr值出現太晚?

    1.擴增效率極低:優化反應條件,嘗試三步法擴增程序,或者重新設計合成引物。

    2.模板濃度太低:減少稀釋度重復實驗,一般未知濃度的樣品先從最高濃度做起。

    3.模板降解:重新制備模板,重復實驗。

    4.體系中存在PCR抑制劑:一般為模板帶入,加大模板稀釋倍數或者重新制備模板重復實驗。


    溶解曲線出現多峰?

    1.引物設計不優:根據設計原則設計合成新的引物;莖環法可嘗試引物設計時向前延伸幾個堿基,增加引物特異性。

    2.引物濃度太高:適當降低引物濃度。

    3cDNA模板帶有基因組污染:重新制備cDNA模板。


    ·陰性對照出現明顯擴增?

    1.反應體系污染:更換新的MixddH2O、引物重復實驗。反應體系在超凈工作臺內配制,減少氣溶膠污染。

    2.引物二聚體的出現:配合熔解曲線進行分析。


    實驗重復性差?

    1.加樣體積失準:配制反應體系時盡量使用大體積移液配制,同時使用性能較好的移液槍和低吸附耗材。

    2.定量PCR儀不同位置溫度控制不一致:定期校準儀器。

    3.模板濃度太低:模板濃度越低,重復性越差,減少模板稀釋度或提高加樣體積。

    ·絕對定量時標準曲線線性關系不佳?

    1.稀釋誤差:采用逐級稀釋法進行模板稀釋,配制反應體系時盡量使用大體積移液配制,同時使用性能較好的移液槍和低吸附耗。
    2.系計算。

    3.引物擴增效率差:根據設計原則設計合成新的引物。

    4.標準品降解:重新制備標準品,重復實驗。


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